Endotoxinas bacterianas

Adequabilidade do método e preparo do teste

O teste de endotoxina bacteriana é usado para detectar ou quantificar endotoxinas de bactérias gram negativas presentes em amostras para qual o teste é preconizado. Utiliza-se o extrato aquoso dos amebócitos circulantes do Limulus polyphemus ou do Tachypleus tridentatus preparado e caracterizado como reagente LAL.

MÉTODOS FOTOMÉTRICOS quantitativos que incluem:

- Método turbidimétrico (baseado no desenvolvimento de turbidez após quebra de um substrato endógeno);

- Método cromogênico (baseado no desenvolvimento de cor após quebra de um complexo peptídeo sintético cromógeno).

Qualquer um destes procedimentos pode ser realizado, a menos que indicado contrário na monografia.

No método de coagulação em gel, a determinação do ponto final da reação é feita a partir de diluições da substância sob teste em comparação direta com diluições paralelas da endotoxina padrão. As quantidades de endotoxinas são expressas em unidades de endotoxina (UE) definidas.

Nota 1: 1 UE é igual a 1 UI (unidade internacional).

O reagente LAL (lisado de amemócito de Limulus sp.) é preparado para as leituras turbidimétricas ou colorimétricas e estes procedimentos podem ser utilizados se cumprirem os requisitos dos métodos.

Para sua calibração é necessária a elaboração de uma curva padrão obtendo-se a sua regressão linear, na qual se determina, por interpolação, a concentração de endotoxina da substância sob teste.

O procedimento inclui incubação da endotoxina padrão para obtenção de uma curva de calibração e das soluções controle com reagente LAL, por tempo pré-determinado e leitura espectrofotométrica no comprimento de onda adequado.

No caso do procedimento do método turbidimétrico, a leitura é feita imediatamente após período final de incubação, e para o procedimento colorimétrico a reação enzimática é interrompida no final do tempo pré-determinado pela adição do reagente, antes das leituras. Para os procedimentos cinéticos turbidimétricos e colorimétricos os valores de absorbância medida durante o período da reação e valores de velocidades são determinados para aquelas leituras.

VIDRARIAS E MATERIAIS DESCARTÁVEIS

Todas as vidrarias devem ser despirogenisadas em estufa usando um processo validado. Utilizar um tempo e temperatura mínimos de 250ºC por 30 minutos. Se utilizar descartáveis plásticos, como ponteiras e pipetas, usar somente os certificados que indicam ser livres de endotoxinas para não haver interferência no teste.

PREPARAÇÃO DA ENDOTOXINA PADRÃO DE REFERÊNCIA E DO PADRÃO DE ENDOTOXINA

O padrão de endotoxina de referência tem uma potência definida de 10 000 UE (unidades de endotoxina) por frasco. Reconstituir o frasco com 5 mL de água grau reagente LAL (livre de pirogênio) e agitar em vórtex intermitentemente por 30 minutos. Usar essa solução concentrada

(Conservada em refrigerador por não mais que 14 dias) para fazer diluições seriadas.

Agitar vigorosamente antes do uso por pelo menos três minutos e proceder às diluições seriadas, agitando no mínimo 30 segundos antes das próximas diluições. Após o uso, desprezar as diluições devido à perda de atividade por adsorção. Para a preparação do padrão de endotoxina, seguir as orientações do fornecedor, certificados no laudo de endotoxina.

PREPARO PARA O TESTE

Usar reagente LAL com sensibilidade declarada confirmada. A validade dos resultados do teste para endotoxinas bacterianas requer a demonstração de que as amostras, soluções de lavagens ou extratos sob teste não inibem ou potencializam a reação e tampouco interferem com o teste. A validação é realizada por meio de teste de inibição ou potencialização descrito para cada uma das técnicas indicadas. São incluídos controles negativos apropriados. A validação deve ser repetida se houver mudança na origem do reagente LAL, no método de produção ou na formulação da substância sob teste.

Solução amostra: preparar a solução de amostra, solubilizando em água grau reagente LAL. Se necessário, ajustar o pH da solução da amostra para que a mistura do reagente LAL com amostra apresente pH entre 6 e 8. O pH pode ser ajustado usando um tampão adequado recomendado pelo fornecedor. Ácidos e bases podem ser preparados com água grau reagente LAL e ser validados para serem livres de endotoxinas e fatores de interferentes.

DETERMINAÇÃO DA MÁXIMA DILUIÇÃO VÁLIDA (MDV)

A máxima diluição válida é a máxima diluição permitida da amostra em análise onde o limite de

endotoxina pode ser determinado. Ela se aplica para injeções ou soluções de administração parenteral na forma reconstituída ou diluída para administração, quantidade de fármaco por peso, se o volume da forma da dosagem for variável.

A fórmula para o cálculo da MDV é a seguinte:

𝑀𝐷𝑉 = 𝑙𝑖𝑚𝑖𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑑𝑜𝑡𝑜𝑥𝑖𝑛𝑎

𝜆

λ = é a sensibilidade rotulada do reagente de LAL.

Nota 2: fórmula utilizada quando o limite de endotoxina do fármaco especificado na monografia estiver em volume (UE/mL).

Quando limite de endotoxina do fármaco especificado na monografia estiver em peso (UE/mg) ou em unidade do fármaco ativo (UE/unidades), o MDV é calculado pela seguinte fórmula:

𝑀𝐷𝑉 = 𝑙𝑖𝑚𝑖𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑑𝑜𝑡𝑜𝑥𝑖𝑛𝑎 × 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑑𝑎 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑛𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜

𝜆

λ = sensibilidade rotulada do reagente de LAL.

O MDV obtido é o fator de diluição limite para que o teste seja validado.

ESTABELECIMENTO DO LIMITE DE ENDOTOXINA

A fórmula para estabelecer limite de endotoxina para drogas parenterais é:

LE = K

M

LE = limite de endotoxina;

K =dose limite humana de endotoxina por quilo de peso corpóreo;

M = máxima dose do produto por kg de peso em um período de uma hora.

O limite de endotoxina é especificado nas monografias individuais das drogas parenterais em

UE/mL, UE/mg ou UE/unidade de atividade biológica.

Exemplo de cálculo para um produto de dosagem 25mg/mL

Onde:

M = máxima dose terapêutica recomendada (mg/kg) = 2,5mg/Kg

C = Concentração da solução stock da amostra (mg/mL) = 25mg/mL

K = Limite de tolerância para produtos parenterais (EU/kg) =

5 EU/kg drogas parenterais.

0,2 EU/kg administradas intratecalmente

𝜆 = sensibilidade do LAL (EU/mL) = 0,03EU/mL

Nota 3: Pode-se escolher outras sensibilidades como por exemplo 0,06EU/mL, 0,125EU/mL ou

no caso de teste cinético a partir da sensibilidade do cartucho ou reagente requerido pelo

equipamento.

Limite de Endotoxina (EL) expresso em EU/mg

LE = K

M

LE = 5,0 EU/kg = 2 EU/mg

2,5 mg/kg

Limite de Endotoxina (LE) expresso em EU/mL

LE = K x C

M

LE = 5,0 EU/kg x 25mg/mL = 50 EU/mL

2,5mg/kg

Mínima Concentração Válida em mg/mL (MCV)

MCV = 𝜆 x M

K

MCV = 0,03 EU/mL x 2,5mg/kg = 0,015mg/mL

5 EU/kg

Máxima Diluição Válida em mg/mL (MDV)

MVD = LE x C

𝜆

LE = Limite de tolerância de endotoxina no produto em EU/mg

MDV = 2 x 25mg/mL = 1: 1.666

0,03 EU/mL

TÉCNICA DE COAGULAÇÃO EM GEL ​

A técnica da coagulação em gel permite a detecção e quantificação de endotoxinas baseada na reação de gelificação do reagente LAL. A sensibilidade do LAL rotulada é a concentração de endotoxina necessária para causar uma gelificação do reagente LAL. Teste para confirmação de sensibilidade do LAL Confirmar a sensibilidade declarada do LAL usando no mínimo um frasco de reagente LAL e preparar uma série de diluições de endotoxina usando o padrão de Endotoxina de referência (RSE) ou o padrão de Endotoxina (CSE), com razão geométrica igual a 2 para obter as concentrações de 0,25 λ, 0,5 λ, λ e 2 λs, onde λ é a sensibilidade declarada do LAL em UE/mL. Executar o teste com as quatro concentrações do padrão de endotoxina em quadruplicata e incluir controles negativos. A média geométrica da concentração do ponto final, cujo cálculo e interpretação encontram-se a seguir, deve ser maior ou igual a 0,5 λ e menor ou igual a 2 λ. A confirmação da sensibilidade do LAL deve ser realizada para cada novo lote de LAL.

Preparação da curva padrão

A solução da curva padrão deve ser testada diariamente com as amostras. Reconstituir a Endotoxina Liofilizada conforme recomendação do fabricante para obter a solução estoque na concentração determinada pelo fornecedor.

Estocar de 2º à 8ºC por no máximo 4 semanas ou conforme recomendação do fabricante. Caso esta solução estoque esteja refrigerada, permita que atinja a temperatura ambiente antes de agitar. A solução estoque de endotoxina nunca deve ser congelada.

Agite a solução estoque vigorosamente conforme recomendação do fabricante. Com uma micropipeta e ponteira apirogênica, transferir 1ml da solução estoque do padrão em um tubo despirogenizado contendo um volume apropriado de água apirogênica (conforme cálculo abaixo) para atingir uma concentração de 5,0EU/mg:

​V (mL) de água = 1,0mL X CSE Potência (EU/mL) - 1,0mL

5,0 EU/mL (Conc. desejada)

Portanto: Para preparar a Concentração do Padrão de 5 EU/mL, colocar em um tubo apirogênico 1mL de endotoxina + V (mL) de água encontrado acima. (Esta é a concentração da solução padrão de 5 EU/ mL). Usar a Solução de Concentração do Padrão de 5,0 EU/mL para

obter a curva padrão com resultados de 0,25 a 0,008 EU/mL conforme tabela abaixo:

Cálculo e interpretação. O ponto final de gelificação é o último teste da série decrescente de Concentração de endotoxina padrão que formou gel. Calcular a média geométrica logarítmica dos pontos finais de gelificação e o antilog da média pela fórmula:

𝑀é𝑑𝑖𝑎 𝑔𝑒𝑜𝑚é𝑡𝑟𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑎 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑑𝑜 𝑝𝑜𝑛𝑡𝑜 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 = 𝑎𝑛𝑡𝑖𝑙𝑜𝑔 𝐸𝑒

𝑓

Ee = soma dos logs das concentrações do ponto final da série de diluições utilizada;

f = número de replicatas.

A sensibilidade do reagente LAL em UE/mL é calculada pela fórmula acima e deve ser, no

mínimo, 0,5 λ e, no máximo, 2 λ.

Testes de interferências no método coagulação em gel (Inibição/Potencialização)

Realizar o teste em alíquotas da amostra na qual não há endotoxina detectável e em diluições que não exceda o MDV (máxima diluição válida). Executar o teste, como no procedimento do teste, na amostra sem adição de endotoxina (solução A) e na amostra com endotoxina adicionada (solução B), nas concentrações de ¼ λ, ½ λ, 1 λ e 2 λ, em quadruplicatas, e testando também em paralelo as mesmas concentrações de endotoxina em água (solução C) e controle negativo em água grau reagente LAL (solução D) em duplicata.

Calcular a média geométrica da concentração de endotoxina do ponto final de gelificação da amostra como descrito no procedimento do teste acima (teste para confirmação da sensibilidade do LAL).

O teste é válido para a amostra sob análise se a média geométrica desta concentração for maior ou igual a 0,5 λ e menor ou igual a 2 λ. Se o resultado obtido nas amostras nas quais foram adicionadas endotoxina estiver fora do limite especificado, o teste de inibição ou potencialização de endotoxina deverá ser repetido após neutralização, inativação ou remoção das substâncias interferentes ou após a diluição da amostra por fator que não exceda a MDV.

Repetir o teste numa diluição maior não excedendo a MDV ou usar um LAL de sensibilidade maior para que a interferência possa ser eliminada na amostra analisada. Interferências podem ser eliminadas por um tratamento adequado como filtração, neutralização, diálise ou aquecimento.

Procedimento. Realizar os testes em duplicatas com as soluções A, B, C e D como se segue.

Preparar solução de amostra diluída sem adição de endotoxina (solução A); com adição de endotoxina (controle positivo do produto) a 2 λ (solução B); água grau reagente LAL com adição de endotoxina a 2 λ (solução C) e água grau reagente LAL sem adição de endotoxina (solução D - controle negativo).

A diluição da solução A e B não deve ultrapassar o MDV.

Interpretação. O teste somente será valido se as réplicas dos controles positivos das soluções B e C formarem gel e a réplicas dos controles negativos das soluções A e C não formarem gel.

Resultados contrários não serão válidos e deverão ser repetidos.

Ensaio do teste pela coagulação em gel

Homogeneizar um volume (por exemplo, 100 μL) de LAL com igual volume das soluções acima, amostra, padrões e controle negativo do teste em tubos de ensaio 10 x 75 mm, em duplicatas. Incubar os tubos por uma hora a (37 ± 1) ºC, evitando vibrações. Após este período, retirar os tubos um a um,virando a 180 graus e verificando a integridade do gel; se o gel permanecer firme após a inversão dos tubos, considerar o resultado como positivo, e se não houver formação de gel ou o mesmo não se apresentar firme, considerar como negativo.

O teste somente será válido se as seguintes condições forem obedecidas:

- Se ambas as réplicas do controle negativo (D) apresentarem reações negativas;

- Se ambas as réplicas do controle positivo do produto (B) apresentarem reações positivas;

- Se a média geométrica da solução C estiver dentro da faixa de 0,5 λ a 2 λ.

Para calcular a concentração de endotoxina da solução A, calcular a concentração do ponto final de cada réplica da série de diluições, multiplicando cada fator de diluição do ponto final pela sensibilidade rotulada do reagente LAL (λ). A concentração de endotoxina na solução

teste é a média geométrica da concentração do limite das réplicas.

Se o teste é realizado na amostra diluída, determinar a concentração de endotoxina na solução original multiplicando o resultado pelo fator de diluição da amostra. Se nenhuma das diluições da amostra teste for positiva, expressar o resultado da concentração de endotoxina como menor que a sensibilidade do LAL (λ) ou menor do que a sensibilidade do LAL multiplicado pelo menor fator de diluição da amostra. Se todas as diluições da amostra apresentarem reações positivas, a concentração de endotoxina é expressa como igual ou maior que λ multiplicado pelo mais alto fator de diluição da amostra.

A amostra encontra os requerimentos do teste se a concentração de endotoxina for menor do que o limite individual especificado na monografia.

TÉCNICAS FOTOMÉTRICAS

Os métodos fotométricos quantitativos incluem:

A. Método cinético turbidimétrico: baseado no desenvolvimento de turbidez após quebra de um

substrato endógeno.

B. Método cinético cromogênico: baseado no desenvolvimento de cor após quebra de um

complexo peptídeo sintético cromógeno.

C. Método cromogênico limite (endpoint).

D. Método turbidimétrico limite (endpoint).

TÉCNICA TURBIDIMÉTRICA

Esta técnica baseia-se na medida de aumento de turbidez e, dependendo do princípio empregado, pode ser classificado em dois tipos:

A. Limite turbidimétrico: baseado na relação entre a concentração de endotoxina e a turbidez (absorvância ou transmissão) da reação.

B. Cinético turbidimétrico: método baseado no tempo de reação (onset time) necessário para a mistura de a reação atingir uma absorvância pré-determinada ou na relação de desenvolvimento de turbidez.

O teste é realizado numa temperatura de incubação recomendada de (37 ± 1) ºC.

TÉCNICA CROMOGÊNICA

Esta técnica é baseada na medida de um cromóforo liberado por um peptídeo cromogênico pela reação da endotoxina com o lisado e dependendo do princípio empregado pode ser classificado em dois tipos:

A. Teste cromogênico limite: baseado na relação entre a concentração de endotoxina e a quantidade do cromóforo liberado no final de um período de incubação.

B. Teste cinético cromogênico: baseado na medida do tempo de reação (onset time) necessário para a mistura de a reação atingir uma pré-determinada absorvância ou na velocidade de desenvolvimentode cor.

O teste é realizado numa temperatura de incubação recomendada de (37 ± 1) ºC.

Preparo do teste

Para assegurar a precisão e validade dos testes turbidimétricos e cromogênicos, testespreparatórios são realizados para assegurar que os critérios para a curva padrão são satisfatórios e que a amostra em teste não interfere com o teste. A validação do método é requerida quando qualquer mudança nas condições experimentais é realizada e pode interferir no teste.

Critérios para a curva padrão

Preparar uma curva padrão utilizando três concentrações de endotoxina, usando uma solução preparada de padrão de endotoxina, e realizar o teste no mínimo em triplicata de cada concentração, como recomendado pelo fornecedor do LAL (relação de volume, tempo de incubação, temperatura e pH, etc.)

Se for desejado uma faixa maior que 2 logs, uma concentração padrão deverá ser adicionada para aumentar a faixa da curva padrão. O valor absoluto de correlação linear R deverá ser maior ou igual a 0,980 para a faixa de concentração de endotoxina indicada pelo fornecedor de LAL.

TESTE PARA FATORES DE INTERFERÊNCIA PARA AS TÉCNICAS FOTOMÉTRICAS

Preparar soluções de amostra diluída sem exceder a MDV (máxima diluição válida) sem endotoxina (solução A) e com endotoxina adicionada (solução B) na concentração igual ou próxima do ponto médio da curva padrão. Preparar uma série de controle positivo com soluções de endotoxina (sedução C) com três concentrações diferentes e também o controle negativo com água apirogênica (solução D) e realizar os testes adicionando reagente LAL, no mínimo, em duplicata (seguir as orientações do reagente utilizado com relação ao volume de amostra e do reagente, tempo de incubação, etc), o ponto mais baixo da curva é considerado λ.

Calcular a média de recuperação da endotoxina adicionada à amostra subtraindo-se a média da concentração de endotoxina na solução teste (solução A), se houver, da média da solução cuja endotoxina foi adicionada (solução B).

A solução teste é considerada livre de interferentes se a medida da concentração de endotoxina adicionada à solução teste (solução B) estiver na faixa de 50% a 200% de recuperação, após subtração de qualquer endotoxina detectada na solução sem adição de endotoxina.

Quando a recuperação de endotoxina estiver na faixa de especificação, fatores interferentes devem ser removidos conforme descritos na seção da técnica de coagulação em gel.

Procedimento

Seguir os procedimentos descritos acima nos itens: Preparo para o teste e Testes para fatores interferentes.

Cálculos para técnicas fotométricas

Calcular a concentração de endotoxina para cada replicata da solução A, usando a curva padrão gerada pela série de controle positivo solução C.

O teste somente é válido com o cumprimento dos três requisitos:

- O resultado obtido da solução D (controle negativo) não exceder o limite do valor do branco requerido na descrição do lisado empregado;

- O resultado obtido com a série de controle positivo, solução C, estiver de acordo com os requerimentos para validação definidos nos critérios para curva padrão;

- A recuperação de endotoxina, calculada a partir da endotoxina encontrada na solução B após subtração da concentração de endotoxina encontrada na solução A estiver dentro da faixa de 50 a 200%.

Interpretação dos resultados em ensaios fotométricos

A solução de amostra a ser examinada estará de acordo com o teste se a média da concentração de endotoxina encontrada nas replicatas (solução A), após correção para diluição e concentração, for menor que o limite de endotoxina do produto testado.

REAGENTES

Lisado de amebócito

O lisado de amebócito é um liofilizado obtido do lisado de amebócitos de crustáceo em forma de ferradura (Limulus polyphemus ou Tachypleus tridentatus). Este reagente refere-se apenas ao produto manufaturado de acordo com as regulamentações de autoridade competente. O lisado reage também com alguns B-Glucanos além de endotoxinas. Preparado do lisado que não reage com B-Glucanos também estão disponíveis; eles são preparados ou por remoção ou por inibição do fator G, que reage com os glucanos. Estes preparados podem ser utilizados para teste de endotoxina na presença de glucanos.

Reconstituição do reagente

Solubilizar o lisado de amebócito (LAL) em água grau reagente para BET (teste de endotoxina bacteriana) ou tampão, sem agitação, e armazenar o mesmo em refrigerador ou freezer de acordo com a recomendação do fornecedor.

Água para teste de endotoxina bacteriana

A água para o teste é a água para injetáveis ou água produzida por outros procedimentos que demonstre não haver nenhuma reação com o lisado empregado no limite de detecção do reagente.

Referencias

USP - Capítulo <85> Bacterial Endotoxins Test.

USP 42 - NF 37 Capítulo <1227> Validation of microbial recovery from - Pharmacopeial Articles.

Farmacopeia brasileira, 6ª edição, Endotoxinas bacterianas 5.5.2.2

Autor: Rodnei Santos

Este arquivo é de propriedade do autor, seu compartilhamento está restrito a Comunidade Científica e não está autorizado para fins comerciais.