para as separações cromatográficas de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)?
Atualmente, são várias as colunas que podem ser escolhidas para o desenvolvimento de um método cromatográfico. Podem-se variar as dimensões (diâmetro e comprimento), recheio de fase estacionária (fase reversa, fase normal, HILIC), diâmetros da partícula (e se a mesma é esférica ou irregular), recobrimento de carbono, área superficial, fabricante e etc.
Em relação às dimensões da coluna, são várias as considerações e a decisão deve ser baseada nas condições da aplicação em particular.
A Tabela 1 apresenta as dimensões típicas (comprimento e diâmetro), vazões aplicáveis e tamanhos de partículas relacionados com a classificação das principais categorias de colunas de HPLC.
Variando as dimensões é possível obter maior ou menor:
- Sensibilidade;
- Resolução;
- Tempo de análise;
- Backpressure;
- Eficiência;
- Consumo de solvente.
A Eficiência é diretamente proporcional ao comprimento da coluna e inversamente proporcional ao tamanho da partícula (isto é, quanto mais longa a coluna, mais eficiente a separação; quanto menor o diâmetro da partícula, mais eficiente). Porém, um aumento de 2x o comprimento da coluna, somente resulta em uma melhoria de 41 % de resolução e aumenta a pressão do sistema (backpressure).
Colunas menores apresentam menores tempos de análise (o que se torna importante em aplicações com gradientes), enquanto colunas mais longas aumentam a resolução, o tempo de análise e a pressão.
Em relação ao diâmetro da coluna, menores diâmetros garantem picos mais finos, o que resulta em melhores sensibilidades também. Deve-se ressaltar ainda que alguns detectores exigem colunas de menores diâmetros devido às vazões de trabalho (detectores de massas com vazões de fase móvel da ordem de 0,3 a 0,6 mL/min exigem colunas de 2,1 ou 3 mm de diâmetro).
Levando em consideração estes fatores discutidos deve-se também destacar, claro, o quanto se pretende gastar, afinal, colunas menores e com menores diâmetros de partícula são mais caras!
Em relação as opções de fases estacionárias de recheio das colunas, também são vastas as opções de colunas cromatográficas para serem utilizadas em HPLC e muitos são os fornecedores e fabricantes de tais colunas.
Esta lista de possíveis colunas se divide nas categorias de:
- Cromatografia em fase reversa (colunas tipo C18, C8 e etc);
- Cromatografia em fase normal (colunas do tipo sílica, ciano e etc);
- Cromatografia por interações hidrofílicas (HILIC) (é uma variante da fase normal, com características da fase reversa e iônica);
- Cromatografia de íons;
- Cromatografia de exclusão (GPC – cromatografia de permeação em gel);
- Cromatografia de afinidade;
- Cromatografia quiral.
Além disso, as colunas podem diferir no comprimento, diâmetro interno, diâmetro de partícula, recobrimento da partícula, porosidade, características morfológicas da partícula (esféricas ou irregulares), área superficial, entre outros.
A Farmacopeia Americana (USP) criou uma codificação (L code) que direciona para o tipo de coluna a ser utilizada em determinado método farmacopeico. Cabe ao analista a tarefa, as vezes árdua, de escolher o tipo certo de coluna, atender ainda a codificação USP e obter os bons resultados desejáveis.
Quanto menores os diâmetros de partícula, maior eficiência de pico (picos mais estreitos) e, portanto, maior resolução, com menor tempo de análise.
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Autora: Dra. Glaucia Maria