O que é um HPLC?

Um guia básico para iniciantes em Cromatografia Líquida de Alta Eficiência.

A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) ou em inglês high performance liquid chromatography (HPLC) é um método analítico amplamente utilizado que separa, detecta e identifica compostos em uma mistura com base em suas diferentes propriedades físicas. Este método analítico funciona passando uma amostra líquida por uma coluna cromatográfica (comparativo de colunas cromatográficas) onde diferentes substâncias serão separadas com base em suas propriedades químicas. O processo deste método analítico utiliza variados tipos de fase estacionária (colunas cromatográficas) que são revestidas com diferentes tipos de materiais adsorventes, o que determina o tipo de composto que a coluna irá separar de uma mistura. Cada fase estacionária tem um componente primário e componentes secundários.

- O componente primário é um material adsorvente que liga os compostos polares; é comumente referido como um agente eluato ou ligante;

- Os componentes secundários são quaisquer materiais adicionais que ajudam a ligar os compostos polares, tais como um auxiliar, material de embalagem, agentes desmoldantes e aditivos.

Condições habituais empregadas ao HPLC

As analises em HPLC são normalmente realizadas à temperatura ambiente (25-27°C), mas existem sistemas de alto desempenho que podem ser controlados a temperaturas mais altas ou mais baixas. Você também verá sistemas de HPLC usados com diferentes níveis de vácuo variando de menos de 10-5 Torr, 10-5 a 10-6 Torr, e 10-6 a 10-7 Torr. Há muitos fatores que podem ser ajustados para melhorar a separação, mas na maioria das vezes a separação é afetada pela fase móvel que é dividida em duas partes chamadas Fase Móvel A e Fase Móvel B. A proporção da Fase Móvel A e Fase Móvel B afetará a separação dos compostos e a taxa de fluxo determinará quanto de cada composto passa através da coluna. O tempo de retenção dos compostos também é afetado pela taxa de fluxo, temperatura e outros parâmetros.

Tipos de colunas para HPLC

Há muitos tipos de colunas para HPLC, e a coluna é geralmente selecionada com base nos compostos que você deseja analisar, no tipo de separação que você deseja e no custo de uma analise. Pode-se escolher entre colunas revestidas, com filme fino e empacotadas. As colunas revestidas são as mais comuns e são geralmente utilizadas para cromatografia líquida. Elas são capazes de separar os compostos com base em sua polaridade e são revestidas com uma fase estacionária que é composta de material adsorvente. As colunas de filme fino estão sendo cada vez mais utilizadas em cromatografia líquida de alto desempenho. Elas são capazes de separar compostos com base em sua polaridade e são compostas de uma película fina de material adsorvente, e são mais capazes de separar mais compostos polares do que as colunas revestidas. As colunas empacotadas são usadas principalmente na análise de proteínas e são capazes de separar compostos com base em sua polaridade. Elas são compostas de uma coluna empacotada onde são capazes de separar os compostos com base em sua polaridade e têm diferentes tamanhos de embalagem para separar diferentes tipos de compostos. Para saber mais sobre os tipos de colunas, veja em colunas cromatográficas.

Diferentes Tipos de Adsorventes para Compostos Polares

Há muitos materiais adsorventes diferentes que podem ser usados em colunas HPLC para separar compostos polares. Portanto, os tipos mais comuns de adsorventes utilizados são mostrados abaixo.

Poliéteres: Estes são compostos polares e têm alta afinidade com os compostos polares. São utilizados para a remoção de impurezas e embalagens de alta eficiência.

Sílica amina-funcionalizada: Estes são compostos polares e têm alta afinidade para grupos de aminoácidos. Portanto, são utilizados em colunas de sílica amino-funcionalizada para separação de proteínas.

Ácidos carboxílicos: Estes são compostos polares que possuem grupos de ácido carboxílico. Portanto, são utilizados em colunas de sílica carboxílico-funcionalizada com ácido carboxílico para separação de compostos orgânicos.

Copolímero de ácido metacrílico: Estes são compostos polares que possuem grupos de ácido metacrílico. Portanto, são utilizados em colunas de copolímero de ácido metacrílico para a separação de compostos polares.

Separação de Compostos Não Polares e Polares

A separação dos compostos polares é feita por adsorção. Portanto, diferentes adsorventes com diferentes materiais adsorventes podem ser usados para separar os compostos polares. As colunas são revestidas com materiais adsorventes e são compostas de diferentes tipos de materiais adsorventes, tais como sílica amino-funcionalizada, sílica carboxílica ácido-funcionalizada ou copolímero de ácido metacrílico. A separação de compostos não-polares é feita por meio de divisórias. Portanto, a coluna pode ser preenchida com compostos não-polares, tais como compostos hidrofóbicos. Em seguida, um composto polar é adicionado à coluna. O composto polar é capaz de se separar dos compostos não-polares, e o composto polar é então separado dos compostos polares.

Detectando o composto que você quer encontrar usando espectro UV ou colorimetria

Há duas maneiras de detectar os compostos em uma mistura. Uma está usando o espectro UV, e a outra está usando a colorimetria. O espectro UV é usado para encontrar os picos no cromatograma, e exibe a absorvância dos compostos. Portanto, ele é usado para encontrar o composto em uma mistura. A outra maneira é usar um detector que seja capaz de medir a absorção da amostra e possa detectar os compostos. Na maioria das vezes, este tipo de detector é um espectrômetro de mobilidade iônica (IMS).

Conclusão

A cromatografia líquida de alta eficiência é um método analítico amplamente utilizado que separa, detecta e identifica compostos em uma mistura com base em suas diferentes propriedades físicas. Funciona passando uma amostra de um líquido por uma coluna onde diferentes substâncias serão separadas com base em suas propriedades químicas. HPLC é uma técnica de separação onde os compostos são separados com base em sua polaridade e na quantidade de cada composto na mistura. Os compostos são separados com base em sua polaridade, e as condições podem ser alteradas para melhorar a separação dos compostos.